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ibidi實驗方案|在流體環(huán)境下細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行粘附實驗-雷萌生物

date:2022-06-29 14:53:13

  該應(yīng)用描述了一種在流動下的粘附試驗,該試驗旨在研究特定細(xì)胞表面分子的作用,以確定它們在細(xì)胞附著和粘附到其他細(xì)胞類型期間的潛在相互作用。

 

  對于我們的方法,我們使用預(yù)染色的鼠腫瘤細(xì)胞(多發(fā)性骨髓瘤:MM)和鼠內(nèi)皮細(xì)胞(EC),然后使用單克隆抗體阻斷我們感興趣的分子之一。簡而言之,將EC接種到ibidi通道μ-SlidesI0.6mmLuer中,并在恒流下培養(yǎng)24小時。為了開始共培養(yǎng),將標(biāo)記的MM細(xì)胞添加到流動容器中并繼續(xù)流動。24小時后,用抗體(以阻斷感興趣的分子)或相應(yīng)的同種型對照處理裝置,并保持流動24小時。第二天,將μ-Slides與流體單元(FU)斷開并清洗以去除非粘附的MM細(xì)胞。為了分析標(biāo)記的MM細(xì)胞對EC的粘附,使用共聚焦顯微鏡獲得了μ-Slides的熒光圖像。

 

  1. 材料和試劑

 

  •MOPC多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞系(ATCC,TIB-23™)

 

  •EOMA內(nèi)皮細(xì)胞(EC)系(ATCC,CRL-2586™)

 

  •含10%FCS的RPMI培養(yǎng)基(FisherScientific,11530586)

 

  •內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(EC培養(yǎng)基、CellBiologics、M1168)

 

  •PBS(泛生物技術(shù),P04-361000)

 

  •非酶細(xì)胞解離溶液(Sigma-Aldrich,C5914-100ML)

 

  •臺盼藍(lán)溶液(Sigma-Aldrich,93595)

 

  •CellTracker™綠色CMFDA染料(ThermoFisher,C7025)

 

  2. 設(shè)備和設(shè)置

 

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  •帶有2個流體單元(FU)的ibidi泵系統(tǒng),每個單元都帶有用于2ml儲液罐的支架(ibidi,10977)

 

  •ibidiμ-SlideI0.6mmLuer,ibiTreat(ibidi,80186)

 

  •ibidiPerfusionSet藍(lán)色,15厘米,內(nèi)徑0.8毫米(ibidi,10961)

 

  •ibidi過濾器/儲液罐套裝,2毫升(ibidi,10972)

 

  •帶細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備的層流罩

 

  •培養(yǎng)箱(所有培養(yǎng)步驟均在37°C和5%CO2下進(jìn)行)

 

  •帶有適當(dāng)濾光片組和照相機(jī)的熒光顯微鏡

 

  •粘度:0.0072(dynxs)/cm²

 

  3.實驗流程

 

  1.準(zhǔn)備EOMA細(xì)胞稀釋液:根據(jù)制造商的說明,使用非酶細(xì)胞解離溶液分離先前培養(yǎng)的EOMA細(xì)胞。使用血細(xì)胞計數(shù)器(Neubauerchamber)對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。在EC培養(yǎng)基中將細(xì)胞稀釋至1.2x106個細(xì)胞/ml的濃度。

 

  2.種入EOMA細(xì)胞:在3個 µ-SlidesI0.6mmLuer(ibidi,80186)中加入150µlEOMA細(xì)胞稀釋液(每個µ-Slide1.75x105EOMA細(xì)胞),然后孵育3小時。

 

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表1:實驗設(shè)置

 

  3.啟動流量:播種三小時后,將2個µ-Slides連接到流體單元FU,使用總量2.7毫升EC培養(yǎng)基。在8.2mbar的壓力下將EOMA細(xì)胞表面的剪切應(yīng)力設(shè)置為0.5dyn/cm²。測量流速并使用兩個FU的平均值來計算校準(zhǔn)因子。提前孵育FU和連接的載玻片過夜。第三個帶有EOMA細(xì)胞的µ-Slide用作靜態(tài)控制。在沒有任何流動的情況下孵育它過夜。

 

  4.準(zhǔn)備MM細(xì)胞:根據(jù)制造商的方案,用CellTrackerGreen(CMFDA)染料在600µlRPMI培養(yǎng)基(不含F(xiàn)CS)中染色6x105MM細(xì)胞。標(biāo)記后,離心細(xì)胞并使用血細(xì)胞計數(shù)器對其進(jìn)行計數(shù)。

 

  5.開始與MM細(xì)胞共培養(yǎng):停止流動并在無菌條件下從FU水庫中取出EC培養(yǎng)基。要開始共培養(yǎng),將RPMI培養(yǎng)基(含10%FCS)和EC培養(yǎng)基以1:1的比例混合,并填充該混合物總體積為2.5ml,其中含有1.5x105MM注入兩個FU儲液罐。將FU重新連接到泵系統(tǒng)并繼續(xù)流動24小時。

 

  6.分子阻斷:將MM細(xì)胞添加到ECs后24小時,用100µg/ml抗體(載玻片 #2)或相應(yīng)的同種型對照(載玻片 #1)處理細(xì)胞,將它們直接添加到FU,無需更換介質(zhì)。將孵育保持在流動狀態(tài)下24小時。

 

  7.清洗和成像:從FU上斷開µ-Slides。用PBS清洗細(xì)胞一次,以去除任何非貼壁細(xì)胞。使用共聚焦顯微鏡獲取熒光圖像,以可視化附著在EC層上的標(biāo)記MM細(xì)胞。

 

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圖1:與同種型對照處理(左圖)相比,阻斷特定表面分子(右圖)時,MM細(xì)胞對ECs的粘附性降低

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